Kromatografia e lëngshme është metoda kryesore për testimin e përmbajtjes së secilit komponent dhe papastërtive në lëndët e para, ndërmjetësuesit, preparatet dhe materialet e paketimit, por shumë substanca nuk kanë metoda standarde ku të mbështeten, prandaj është e pashmangshme zhvillimi i metodave të reja. Në zhvillimin e metodave të fazës së lëngët, kolona kromatografike është thelbi i kromatografisë së lëngshme, kështu që mënyra se si të zgjidhni një kolonë të përshtatshme kromatografike është thelbësore. Në këtë artikull, autori do të shpjegojë se si të zgjidhni një kolonë kromatografie të lëngshme nga tre aspekte: idetë e përgjithshme, konsideratat dhe shtrirja e aplikimit.
A. Idetë e përgjithshme për përzgjedhjen e kolonave të kromatografisë së lëngshme
1. Vlerësoni vetitë fizike dhe kimike të analitit: të tilla si struktura kimike, tretshmëria, qëndrueshmëria (si p.sh. nëse është e lehtë të oksidohet/reduktohet/hidrolizohet), aciditeti dhe alkaliniteti, etj., veçanërisht struktura kimike është çelësi Faktori në përcaktimin e vetive, të tilla si grupi i konjuguar ka absorbim të fortë ultravjollcë dhe fluoreshencë të fortë;
2. Përcaktoni qëllimin e analizës: nëse kërkohet ndarje e lartë, efikasitet i lartë i kolonës, kohë e shkurtër e analizës, ndjeshmëri e lartë, rezistencë ndaj presionit të lartë, jetë e gjatë e kolonës, kosto e ulët, etj.;
- Zgjidhni një kolonë të përshtatshme kromatografike: kuptoni përbërjen, vetitë fizike dhe kimike të mbushësit kromatografik, të tilla si madhësia e grimcave, madhësia e poreve, toleranca ndaj temperaturës, toleranca e pH, adsorbimi i analitit, etj.
- Konsiderata për zgjedhjen e kolonave të kromatografisë së lëngshme
Ky kapitull do të diskutojë faktorët që duhen marrë parasysh kur zgjedh një kolonë kromatografie nga këndvështrimi i vetive fizike dhe kimike të vetë kolonës kromatografike. 2.1 Matrica mbushëse
2.1.1 Matrica e xhelit silicë Matrica mbushëse e shumicës së kolonave të kromatografisë së lëngshme është xhel silicë. Ky lloj mbushësi ka pastërti të lartë, kosto të ulët, forcë të lartë mekanike dhe është e lehtë për t'u modifikuar grupe (të tilla si lidhja fenil, lidhja amino, lidhja ciano, etj.), por vlera e pH dhe diapazoni i temperaturës që toleron janë të kufizuara: Gama e pH e shumicës së mbushësve të matricës së xhelit silicë është 2 deri në 8, por diapazoni i pH i fazave të lidhura me xhel silicë të modifikuar posaçërisht mund të jetë nga 1.5 deri në 10, dhe ka gjithashtu faza të lidhura me xhel silicë të modifikuar posaçërisht që janë të qëndrueshme në pH të ulët. të tilla si Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, i cili është i qëndrueshëm në pH 1 deri në 8; kufiri i sipërm i temperaturës së matricës së xhel silicë është zakonisht 60 ℃, dhe disa kolona kromatografike mund të tolerojnë një temperaturë prej 40 ℃ në pH të lartë.
2.1.2 Matrica polimer Mbushësit polimer janë kryesisht polistiren-divinilbenzen ose polimetakrilat. Përparësitë e tyre janë se ato mund të tolerojnë një gamë të gjerë pH - ato mund të përdoren në intervalin nga 1 deri në 14 dhe janë më rezistente ndaj temperaturave të larta (mund të arrijnë mbi 80 °C). Krahasuar me mbushësit C18 me bazë silicë, ky lloj mbushësi ka hidrofobicitet më të fortë dhe polimeri makroporoz është shumë efektiv në ndarjen e mostrave të tilla si proteinat. Disavantazhet e tij janë se efikasiteti i kolonës është më i ulët dhe forca mekanike është më e dobët se ajo e mbushësve me bazë silicë. 2.2 Forma e grimcave
Shumica e mbushësve modernë HPLC janë grimca sferike, por ndonjëherë ato janë grimca të parregullta. Grimcat sferike mund të sigurojnë presion më të ulët të kolonës, efikasitet më të lartë të kolonës, stabilitet dhe jetë më të gjatë; kur përdoren faza të lëvizshme me viskozitet të lartë (si acidi fosforik) ose kur tretësira e mostrës është viskoze, grimcat e parregullta kanë një sipërfaqe specifike më të madhe, e cila është më e favorshme për veprimin e plotë të dy fazave dhe çmimi është relativisht i ulët. 2.3 Madhësia e grimcave
Sa më e vogël të jetë madhësia e grimcave, aq më i lartë është efikasiteti i kolonës dhe aq më i lartë është ndarja, por aq më e keqe është rezistenca ndaj presionit të lartë. Kolona më e përdorur është kolona e madhësisë së grimcave 5 μm; nëse kërkesa për ndarje është e lartë, mund të zgjidhet një mbushës 1,5-3 μm, i cili është i favorshëm për zgjidhjen e problemit të ndarjes së disa mostrave komplekse të matricës dhe me shumë komponentë. UPLC mund të përdor mbushës 1,5 μm; Mbushësit e madhësisë së grimcave 10 μm ose më të mëdha përdoren shpesh për kolonat gjysmë përgatitore ose përgatitore. 2.4 Përmbajtja e karbonit
Përmbajtja e karbonit i referohet proporcionit të fazës së lidhur në sipërfaqen e xhelit të silicës, e cila lidhet me sipërfaqen specifike dhe mbulimin e fazës së lidhur. Përmbajtja e lartë e karbonit siguron kapacitet të lartë kolone dhe rezolucion të lartë, dhe shpesh përdoret për mostra komplekse që kërkojnë ndarje të lartë, por për shkak të kohës së gjatë të ndërveprimit midis dy fazave, koha e analizës është e gjatë; Kolonat kromatografike me përmbajtje të ulët karboni kanë një kohë analize më të shkurtër dhe mund të tregojnë selektivitete të ndryshme dhe shpesh përdoren për mostra të thjeshta që kërkojnë analiza të shpejta dhe mostra që kërkojnë kushte të larta të fazës ujore. Në përgjithësi, përmbajtja e karbonit të C18 varion nga 7% në 19%. 2.5 Madhësia e poreve dhe sipërfaqja specifike
Mediat e përthithjes HPLC janë grimca poroze dhe shumica e ndërveprimeve ndodhin në pore. Prandaj, molekulat duhet të hyjnë në poret që të absorbohen dhe ndahen.
Madhësia e poreve dhe sipërfaqja specifike janë dy koncepte plotësuese. Madhësia e vogël e poreve nënkupton sipërfaqe të madhe specifike dhe anasjelltas. Një sipërfaqe e madhe specifike mund të rrisë ndërveprimin midis molekulave të mostrës dhe fazave të lidhura, të përmirësojë mbajtjen, të rrisë ngarkesën e mostrës dhe kapacitetin e kolonës dhe ndarjen e përbërësve kompleksë. Mbushësit plotësisht porozë i përkasin këtij lloji mbushësish. Për ata me kërkesa të larta ndarjeje, rekomandohet të zgjidhni mbushës me sipërfaqe të madhe specifike; sipërfaqja e vogël specifike mund të zvogëlojë presionin e kundërt, të përmirësojë efikasitetin e kolonës dhe të zvogëlojë kohën e ekuilibrit, e cila është e përshtatshme për analizën e gradientit. Mbushësit me guaskë bërthamore i përkasin këtij lloji mbushësish. Me premisën e sigurimit të ndarjes, rekomandohet të zgjidhni mbushës me sipërfaqe të vogël specifike për ata me kërkesa të larta të efikasitetit të analizës. 2.6 Vëllimi i poreve dhe forca mekanike
Vëllimi i poreve, i njohur gjithashtu si "vëllimi i poreve", i referohet madhësisë së vëllimit të zbrazët për grimcë njësi. Mund të pasqyrojë mirë forcën mekanike të mbushësit. Forca mekanike e mbushësve me vëllim pore të madhe është pak më e dobët se ajo e mbushësve me vëllim të vogël pore. Mbushësit me vëllim pore më të vogël ose të barabartë me 1.5 mL/g përdoren kryesisht për ndarjen e HPLC, ndërsa mbushësit me vëllim pore më të madh se 1.5 mL/g përdoren kryesisht për kromatografinë e përjashtimit molekular dhe kromatografinë me presion të ulët. 2.7 Norma e mbulimit
Mbulimi mund të zvogëlojë majat e bishtit të shkaktuara nga ndërveprimi midis përbërjeve dhe grupeve të ekspozuara të silanolit (të tilla si lidhja jonike midis përbërjeve alkaline dhe grupeve të silanolit, forcat van der Waals dhe lidhjet hidrogjenore midis përbërjeve acide dhe grupeve të silanolit), duke përmirësuar kështu efikasitetin e kolonës dhe formën e majës . Fazat e lidhura të pambuluara do të prodhojnë përzgjedhje të ndryshme në krahasim me fazat e lidhura me kapak, veçanërisht për mostrat polare.
- Shtrirja e aplikimit të kolonave të ndryshme të kromatografisë së lëngshme
Ky kapitull do të përshkruajë shtrirjen e aplikimit të llojeve të ndryshme të kolonave të kromatografisë së lëngshme përmes disa rasteve.
3.1 Kolona kromatografike C18 me fazë të kundërt
Kolona C18 është kolona më e përdorur me fazë të kundërt, e cila mund të përmbushë testet e përmbajtjes dhe papastërtisë së shumicës së substancave organike dhe është e zbatueshme për substancat me polare të mesme, me polare të dobëta dhe jopolare. Lloji dhe specifikimi i kolonës kromatografike C18 duhet të zgjidhet sipas kërkesave specifike të ndarjes. Për shembull, për substancat me kërkesa të larta për ndarje, shpesh përdoren specifikimet 5 μm*4.6 mm*250 mm; për substancat me matrica ndarëse komplekse dhe polaritet të ngjashëm, mund të përdoren specifikime 4 μm*4.6 mm*250 mm ose madhësi grimcash më të vogla. Për shembull, autori përdori një kolonë 3 μm*4.6 mm*250 mm për të zbuluar dy papastërti gjenotoksike në celecoxib API. Ndarja e dy substancave mund të arrijë në 2.9, që është e shkëlqyer. Përveç kësaj, nën premisën e sigurimit të ndarjes, nëse kërkohet analizë e shpejtë, shpesh zgjidhet një kolonë e shkurtër prej 10 mm ose 15 mm. Për shembull, kur autori përdori LC-MS/MS për të zbuluar një papastërti gjenotoksike në API të fosfatit piperaquine, u përdor një kolonë 3 μm*2.1 mm*100 mm. Ndarja midis papastërtisë dhe përbërësit kryesor ishte 2.0, dhe zbulimi i një kampioni mund të përfundojë në 5 minuta. 3.2 Kolona fenil me fazë të kundërt
Kolona fenil është gjithashtu një lloj kolone me fazë të kundërt. Kjo lloj kolone ka selektivitet të fortë për përbërjet aromatike. Nëse përgjigja e përbërjeve aromatike e matur nga kolona e zakonshme C18 është e dobët, mund të mendoni të zëvendësoni kolonën e fenilit. Për shembull, kur po bëja celecoxib API, përgjigja e komponentit kryesor të matur nga kolona e fenilit të të njëjtit prodhues dhe të njëjtit specifikim (të gjitha 5 μm*4,6 mm*250 mm) ishte rreth 7 herë më e lartë se ajo e kolonës C18. 3.3 Kolona me fazë normale
Si një shtesë efektive për kolonën me fazë të kundërt, kolona me fazë normale është e përshtatshme për komponime shumë polare. Nëse piku është ende shumë i shpejtë kur elutoni me më shumë se 90% fazë ujore në kolonën e fazës së kundërt, madje edhe afër dhe mbivendoset me pikun e tretësit, mund të mendoni të zëvendësoni kolonën e fazës normale. Ky lloj kolone përfshin kolonën hilike, kolonën amino, kolonën ciano, etj.
3.3.1 Kolona Hilike Kolona Hilike zakonisht fut grupe hidrofile në zinxhirin e lidhur alkil për të rritur reagimin ndaj substancave polare. Kjo lloj kolone është e përshtatshme për analizën e substancave të sheqerit. Autori përdori këtë lloj kolone kur bënte përmbajtjen dhe substancat e lidhura me ksilozën dhe derivatet e saj. Izomerët e një derivati të ksilozës gjithashtu mund të ndahen mirë;
3.3.2 Kolona amino dhe kolona ciano Kolona amino dhe kolona ciano i referohen prezantimit të modifikimeve amino dhe ciano në fund të zinxhirit alkil të lidhur, përkatësisht, për të përmirësuar selektivitetin për substanca të veçanta: për shembull, kolona amino është një zgjedhje e mirë. për ndarjen e sheqernave, aminoacideve, bazave dhe amideve; kolona ciano ka selektivitet më të mirë kur ndan substanca të ngjashme strukturore të hidrogjenizuara dhe të pahidrogjenuara për shkak të pranisë së lidhjeve të konjuguara. Kolona amino dhe kolona ciano shpesh mund të ndërrohen midis kolonës së fazës normale dhe kolonës së fazës së kundërt, por ndërrimi i shpeshtë nuk rekomandohet. 3.4 Kolona kirale
Kolona kirale, siç sugjeron edhe emri, është e përshtatshme për ndarjen dhe analizën e përbërjeve kirale, veçanërisht në fushën e farmaceutikës. Ky lloj kolone mund të konsiderohet kur kolonat konvencionale të fazës së kundërt dhe ato të fazës normale nuk mund të arrijnë ndarjen e izomerëve. Për shembull, autori përdori një kolonë kirale 5 μm*4.6 mm*250 mm për të ndarë dy izomerët e 1,2-difenileetilendiaminës: (1S, 2S)-1, 2-difeniletilendiamine dhe (1R, 2R)-1, 2 -difeniletilendiamine, dhe ndarja midis të dyjave arriti rreth 2.0. Sidoqoftë, kolonat kirale janë më të shtrenjta se llojet e tjera të kolonave, zakonisht 1W+/copë. Nëse ka nevojë për kolona të tilla, njësia duhet të bëjë një buxhet të mjaftueshëm. 3.5 Kolona e shkëmbimit të joneve
Kolonat e shkëmbimit të joneve janë të përshtatshme për ndarjen dhe analizën e joneve të ngarkuara, të tilla si jonet, proteinat, acidet nukleike dhe disa substanca të sheqerit. Sipas llojit të mbushësit, ato ndahen në kolona shkëmbimi kationesh, kolona shkëmbimi anionesh dhe kolona shkëmbimi të fortë kationesh.
Kolonat e shkëmbimit të kationeve përfshijnë kolona me bazë kalciumi dhe hidrogjen, të cilat janë kryesisht të përshtatshme për analizën e substancave kationike si aminoacidet. Për shembull, autori përdori kolona me bazë kalciumi kur analizoi glukonatin e kalciumit dhe acetatin e kalciumit në një tretësirë shpëlarëse. Të dyja substancat kishin përgjigje të forta në λ=210nm, dhe shkalla e ndarjes arriti në 3.0; autori përdori kolona me bazë hidrogjeni kur analizoi substancat e lidhura me glukozën. Disa substanca kryesore të lidhura - maltoza, maltotrioza dhe fruktoza - kishin ndjeshmëri të lartë nën detektorë diferencialë, me një kufi zbulimi deri në 0,5 ppm dhe një shkallë ndarjeje prej 2,0-2,5.
Kolonat e shkëmbimit të anionit janë kryesisht të përshtatshme për analizën e substancave anionike si acidet organike dhe jonet halogjene; Kolonat e forta të shkëmbimit të kationeve kanë kapacitet dhe selektivitet më të lartë të shkëmbimit të joneve dhe janë të përshtatshme për ndarjen dhe analizën e mostrave komplekse.
Sa më sipër është vetëm një hyrje në llojet dhe diapazonin e aplikimit të disa kolonave të zakonshme të kromatografisë së lëngshme të kombinuara me përvojën e vetë autorit. Ekzistojnë lloje të tjera të veçanta të kolonave kromatografike në aplikimet aktuale, të tilla si kolonat kromatografike me pore të mëdha, kolonat kromatografike me pore të vogla, kolonat e kromatografisë me afinitet, kolonat kromatografike multimode, kolonat e kromatografisë së lëngshme me performancë ultra të lartë (UHPLC), kolonat e lëngut superkritik (kromatografia SFC), etj. Ato luajnë një rol të rëndësishëm në fusha të ndryshme. Lloji specifik i kolonës kromatografike duhet të zgjidhet sipas strukturës dhe vetive të kampionit, kërkesave të ndarjes dhe qëllimeve të tjera.
Koha e postimit: Qershor-14-2024